Referenční informace. Barviva a zhášedla pro PCR v „reálném čase“. — Syntéza DNA
V moderních verzích real-time PCR se již delší dobu používá současně několik fluorescenčních sond značených různými fluorescenčními barvivy – tzv. „multiplexní“ verze real-time PCR (multiplex Real-Time PCR). To umožňuje současně detekovat několik produktů PCR v jedné zkumavce. Což může být velmi výhodné například v případě stanovení úrovně genové exprese, kdy můžete vzít dvě sondy s různými fluorescenčními barvivy, abyste určili poměr exprese požadovaného genu k „housekeeping“ genu v stejná reakční směs pro stejný vzorek. Mnoho moderních „real-time“ PCR přístrojů má možnosti pro detekci více fluorescenčních barviv současně. K tomu dochází k detekci fluorescenčního signálu z každého barviva ve specifickém rozsahu (kanálu). Tento rozsah je vybrán tak, aby detekoval signál pouze jednoho barviva a nezasahoval do oblasti sousedních.
Obrázek ukazuje fluorescenční spektra pro čtyři barviva: FAM, HEX, ROX a Cy5. Jak můžete vidět, pokud nastavíte zařízení tak, aby detekovalo signál na maximu fluorescence každého barviva, pak zbývající barviva na tomto maximu budou mít velmi nízkou fluorescenci a lze je zanedbat. V tomto případě tedy můžeme získat čtyři nezávislé kanály pro použití v multiplexní PCR v reálném čase. Kanály jsou obvykle pojmenovány podle barviva, jehož maximum detekují. Dnes je všeobecně známo pět kanálů:
1. Kanál FAM/SybrGreen
2. Kanál JOE/HEX
3. Kanál TAMRA/Cy3
4. Kanál ROX/SuperROX
5. Kanál Cy5
Nejběžnější možnosti multiplexní real-time PCR: dva kanály – FAM a HEX, tři kanály – FAM, HEX a Cy5, čtyři kanály – FAM, HEX, ROX a Cy5
Není vůbec nutné, aby se název kanálu shodoval s názvem barviva, hlavní věcí je, že použité barvivo spektrálně odpovídá charakteristikám kanálu. Například pro kanál JOE lze použít sondy s barvivem HEX nebo VIC. Je poměrně obtížné vybrat vhodné barvivo pro použití v real-time PCR, protože je nutné, aby mělo dobré spektrální vlastnosti, tedy fluoreskovalo v požadovaném rozsahu svého kanálu a zároveň nefluoreskovalo v sousedních kanálech. . Velmi důležitá je také jeho chemická a fotostabilita a možnost využití při syntéze oligonukleotidů.
Barviva pro kanál FAM/SybrGreen. Výběr barviv pro tento kanál není velký, jedná se vlastně o samotný FAM. Historicky to bylo první a nejjednodušší barvivo pro mnoho biologických aplikací. V tomto kanálu je také detekován signál při použití interkalačního barviva SybrGreen.
Barviva pro kanál JOE/HEX. Dnes mohou sondy PCR v reálném čase pro druhý kanál používat pět různých fluorescenčních barviv. Jedná se o HEX, JOE, VIC, Yakima Yellow a R6G. Historicky byly barviva HEX a JOE prvními, které používaly barviva pro druhý kanál, takže většina nástrojů PCR v reálném čase vydaných před rokem 2002 má v seznamu kanálů buď pouze kanál JOE nebo kanál JOE/HEX. Společnost Aplied Biosystems vyvinula pro tento kanál vlastní barvivo – VIC, takže nejnovější zařízení od této společnosti obsahují toto barvivo v názvu kanálu.
Každé z těchto barviv má své nevýhody. Barvivo JOE je tedy poměrně pracné a drahé na použití při syntéze oligonukleotidů. HEX barvivo je relativně snadno začleněno do oligonukleotidu a má dobré fluorescenční spektrum, ale nemá vysoký kvantový výtěžek. Totéž platí pro barvivo Yakima Yellow. HEX je dnes pravděpodobně nejrozšířenějším barvivem na světě pro použití v multiplexní PCR v reálném čase. Barvivo R6G je nejlevnější variantou barviva pro tento kanál, má však významnou nevýhodu: na některých přístrojích pro PCR v reálném čase sondy s R6G také fluoreskují v kanálu FAM, což v některých případech ztěžuje interpretaci získaných výsledků. Existují také informace, že „záře“ v kanálu FAM se u sond s R6G v průběhu času zvyšuje. Téměř nikdo na světě nepoužívá sondy s R6G. Pravděpodobně nejvhodnější variantou barviva pro druhý kanál je barvivo VIC, které je ideální svými spektrálními a chemickými vlastnostmi, má však jednu nevýhodu – vysokou cenu.
Kanál TAMRA/Cy3. Barvivo TAMRA bylo svého času široce používáno v PCR v reálném čase jako zhášedlo pro barvivo FAM. TAMRA však může být použita v sondách a jako barvivo. Syntéza oligonukleotidů s TAMRA je náročná na práci a drahá. Alternativní barvivo pro tento kanál je cyanin Cy3, jeho zavedení do oligonukleotidu je relativně jednoduché, ale v kvantovém výtěžku je výrazně horší než TAMRA.
Kanál ROX/SuperROX. Pro tento kanál se používá barvivo ROX. V poslední době se také začíná prosazovat barvivo SuperROX, které se do oligonukleotidu zavádí snadněji než ROX. I pro tento kanál jsou použity sondy značené cyaninovým barvivem Cy3.5, ale ten má ve srovnání s ROX znatelně nižší kvantový výtěžek.
Kanál Cy5. Bohužel pro tento kanál se vzhledem k jeho spektrálním vlastnostem, konkrétně dlouhé vlnové délce při maximu fluorescence – 655 nm, kromě barviva Cy5 cyanin nehodí nic jiného. Samotné barvivo Cy5 má v syntéze oligonukleotidu nemálo omezení, takže jeho syntéza je poměrně drahá a pracná.
<i>Zhášeče pro PCR v reálném čase.</i>
Dnes existuje poměrně málo různých zhášedel, které se používají pro PCR v reálném čase. Hlavním úkolem takového zhášeče je dosáhnout co nejnižší počáteční hodnoty fluorescence (pozadí) sondy, aby pak v důsledku PCR sonda co nejlépe „vzplanula“. K tomu musí mít zhášeč významnou absorpční kapacitu (molární extinkci) v rozsahu fluorescence odpovídajícího fluorescenčního barviva. Na přístrojích pro PCR „v reálném čase“ jsou v zásadě výsledky „vzplanutí“ sondy prezentovány ve formě již zpracovaných a normalizovaných křivek, proto je pro stanovení Ct absolutní hodnota sondy „ vzplanutí“ obecně není důležité. Ke stanovení množství DNA stačí minimální „vzplanutí“, které bude spolehlivě zaznamenáván zařízením PCR v „reálném čase“. Ale abychom měli krásnější křivky a přesněji stanovené hodnoty Ct, je žádoucí dosáhnout nejvyššího poměru fluorescence pozadí/konečná fluorescence.
U sond typu Taqman, ve kterých jsou molekuly zhášeče a barviva odděleny v prostoru, je účinného zhášení dosaženo výběrem zhášedla, které odpovídá spektrálně fluorescenčnímu barvivu. Nejběžnějším a dlouho známým zhášedlem je DABCYL. Funguje dobře pro hašení barviva FAM. Dnes jsou však nejpoužívanějšími hasicími přístroji rodina Black Hole Quenchers (BHQ) od Biosearch.
Tabulka. Možnost kombinace různých zhášedel a barviv v sondách pro real-time PCR.
| Dye/Quencher | BHQ1 | BHQ2 | BHQ3 |
|---|---|---|---|
| FAM | + | – | – |
| HEX | + | + | – |
| ROX | – | + | – |
| Cy5 | – | + | + |
Zhášeč lze vybrat na základě korespondence s vlnovou délkou fluorescence barviva (viz tabulka). Takže pro barvivo FAM je dobrá volba BHQ-1, pro barvivo HEX lze použít BHQ-1 i BHQ-2, pro ROX je vhodný BHQ-2 a pro Cy5 jak BHQ-2, tak BHQ -3 lze použít.
Existuje několik méně běžných hasicích přístrojů. Například zhášeč Eclipse od Epoch, který se dobře hodí pro FAM a částečně HEX barviva. K hašení FAM se navíc často používalo barvivo TAMRA. Druhá možnost samozřejmě nemůže být použita v „multiplexní“ verzi real-time PCR. Pro Beacon sondy už není přesná spektrální shoda mezi zhášečem a barvivem tak důležitá. Vzhledem k tomu, že molekuly zhášedla a barviva jsou v prostoru blízko sebe, dochází k takzvanému „kontaktnímu zhášení“. V tomto případě dokonce páry jako Cy5-DABCYL fungují docela dobře. V zásadě platí, že čím blíže jsou molekuly zhášedla a barviva, tím lepší je zhášecí účinek a nižší fluorescence pozadí. Za tímto účelem byly například vyrobeny varianty sond typu Taqman, ve kterých se molekuly barviva nenacházejí na 5′ konci oligonukleotidu, ale jsou zabudovány do středu řetězce, čímž lze vzdálenost zmenšit na minimálně 6-7 nukleotidů a účinnost „vyhoření“ může být výrazně zvýšena.
